اندازه‌گیری اکراتوکسین A در قهوه با روش HPLC

قهوه، یکی از پرمصرف‌ترین نوشیدنی‌های دنیا، به دلیل شرایط تولید و نگهداری می‌تواند آلوده به سموم قارچی مانند اکراتوکسین A شود. در این مقاله، اهمیت اندازه‌گیری این سم با روش HPLC و تأثیرات آن بر سلامت انسان مورد بررسی قرار گرفته است.

چکیده

اکراتوکسین A یکی از مهم‌ترین مایکوتوکسین‌هاست که توسط گونه‌های خاص قارچ‌های آسپرژیلوس و پنی‌سیلیوم تولید می‌شود. این سم خطرناک در محصولات متعددی از جمله قهوه یافت شده و می‌تواند منجر به جهش‌زایی، سرطان‌زایی و مشکلات کلیوی شود. تحقیقات نشان می‌دهد اکراتوکسین A در برابر حرارت مقاوم است و حتی در فرآیندهای حرارتی معمول نیز از بین نمی‌رود. اندازه‌گیری اکراتوکسین A در قهوه با روش HPLC امکان شناسایی و اندازه‌گیری دقیق این سم در محصولات غذایی فراهم شده است.

مقدمه

پس از کشف آفلاتوکسین‌ها، اکراتوکسین‌ها به‌عنوان دومین گروه اصلی مایکوتوکسین‌ها توجه محققان را به خود جلب کردند. اکراتوکسین A، که در سال 1965 در آفریقای جنوبی کشف شد، به دلیل ساختار شیمیایی پیچیده‌اش تأثیرات مخربی بر سلامت انسان دارد. این سم از طریق مهار آنزیم‌های کلیدی، ساخت پروتئین در سلول‌های بدن را متوقف کرده و موجب آسیب به DNA می‌شود.

قهوه و آلودگی به اکراتوکسین

قهوه، یکی از پرطرفدارترین نوشیدنی‌های گرم در جهان، به دلیل شرایط کشاورزی خاص ممکن است به اکراتوکسین آلوده شود. این آلودگی معمولاً در مراحل کشت، برداشت، فرآوری و نگهداری رخ می‌دهد. علاوه بر این، استفاده از خوراک دام آلوده می‌تواند اکراتوکسین را به محصولات گوشتی و لبنی منتقل کند.

تاریخچه کشف قارچ‌های تولیدکننده اکراتوکسین

قارچ آسپرژیلوس اکراسئوس، که اولین‌بار توسط کارل ویلهلم در سال 1877 کشف شد، به‌عنوان یکی از تولیدکنندگان اصلی اکراتوکسین شناخته می‌شود. این قارچ در دماهای بالا و شرایط مرطوب به خوبی رشد می‌کند و دانه‌های قهوه یکی از محیط‌های مناسب برای رشد آن به‌شمار می‌آیند.

روش آزمون اندازه‌گیری اکراتوکسین A در قهوه با روش HPLC

اساس روش

اندازه‌گیری اکراتوکسین A با استفاده از روش کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC) شامل مراحل زیر است:

استخراج آنالیت از نمونه با استفاده از حلال

عبور عصاره از ستون ایمونوافینیتی دارای آنتی‌بادی‌های اختصاصی

شستشو با متانول و جمع‌آوری آنالیت

تزریق نمونه به دستگاه HPLC برای تعیین مقدار سم

مواد مصرفی

محلول‌های بافری مانند PBS

حلال‌هایی از جمله استونیتریل و متانول با گرید HPLC

استانداردهای مرجع اکراتوکسین

تجهیزات آزمایشگاهی

این فرآیند نیازمند تجهیزاتی مانند ستون ایمونوافینیتی، پمپ خلا، pH متر، بن‌ماری، و دستگاه HPLC با دتکتور فلورسانس است.

مراحل عملیاتی

توزین 25 گرم از نمونه همراه با 1 گرم نمک

مخلوط‌کردن با 100 میلی‌لیتر حلال استخراج

تصفیه عصاره با کاغذ صافی و رقیق‌کردن

عبور محلول از ستون ایمونوافینیتی و جمع‌آوری عصاره نهایی

تزریق نمونه به دستگاه HPLC برای تحلیل نهایی

قارچ‌های تولیدکننده اکراتوکسین A

قارچ‌های آسپرژیلوس اکراسئوس و پنی‌سیلیوم وروکوزوم اصلی‌ترین عوامل تولید اکراتوکسین A هستند. دما و رطوبت محیط نقش کلیدی در تولید این سم دارند. به‌عنوان نمونه:

آسپرژیلوس اکراسئوس: دمای بهینه 25-30 درجه سانتی‌گراد و فعالیت آبی 0.99

پنی‌سیلیوم وروکوزوم: دمای بهینه 20 درجه سانتی‌گراد و فعالیت آبی 0.95-0.99

شرایط تولید اکراتوکسین A

اکراتوکسین A، در مناطق دارای آب و هوای معتدل بیشتر توسط قارچ پنی سیلیوم وروکوزوم و در مناطق گرمسیری بیشتر توسط قارچ آسپرژیلوس اکراسئوس تولید می شود. از آنجایی دانه های قهوه و کاکائو برای رشد به شرایط گرم تری نیاز دارند، بنابراین در این محصولات، آلودگی با اکراتوکسین را میتوان به قارچ آسپرژیلوس اکراسئوس نسبت داد.

و از طرفی، غلات برای رشد نیاز به آب و هوای خنک تری دارند، بنابراین میتوان گفت آلودگی غلات به اکراتوکسین، بیشتر توسط رشد قارچ پنی سیلیوم وروکوزوم صورت می گیرد.

قارچ آسپرژیلوس اکراسئوس در دانه های روغنی مانند بادام زمینی و سویا بهتر از دانه هایی مانند گندم و ذرت رشد می کند اما پنی سیلیوم وروکوزوم روی ذرت و گندم رشد بهتری دارد.

تحقیقات نشان می دهد که برای تولید اکراتوکسین A روی دانه قهوه، به رطوبت دانه بالای 13 درصد نیاز است، این درحالی است که برای تولید اکراتوکسین A روی دانه های غلات، به میزان 18 تا 22 درصد رطوبت نیاز است.

شرایط رشدی قارچ ها در هنگام تولید اکراتوکسین در جدول زیر ذکر شده است:

استانداردهای مجاز اکراتوکسین A در محصولات غذایی

براساس استاندارد ملی ایران:

قهوه برشته شده: حداکثر 5 µg/kg

قهوه فوری: حداکثر 10 µg/kg

آسیب‌های سلامتی ناشی از اکراتوکسین A

اکراتوکسین A می‌تواند به DNA متصل شده و باعث ایجاد جهش ژنتیکی شود. این سم همچنین با تجمع در کبد، کلیه‌ها و سیستم ایمنی منجر به اختلالات جدی مانند ناباروری، نقص‌های مادرزادی و کاهش ایمنی می‌شود.

سازمان جهانی بهداشت  و کمیته مشترک سازمان خواربار و کشاورزی ملل متحد (FAO) مقدار جذب موقت هفتگی قابل تحمل برای انسان (PTWI)، را 100 نانوگرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن در هفته اعلام کرده اند. وزن تقریبی هر دانه نمک، 50000 نانوگرم است که یک دانه نمک وزنی حدود 500 برابر میزان توصیه شده و حد مجاز دریافت هفتگی اکراتوکسین A توسط انسان دارد.

بیشینه رواداری اکراتوکسین  Aبرای محصولات مختلف متفاوت می باشد که این مقادیر بر اساس آخرین تغییرات استاندارد ملی ایران به شماره 5925 در سال 1399 در جدول زیر گزارش شده است.

تأثیر اکراتوکسین روی سلامت انسان

مصرف قهوه آلوده به اکراتوکسین A می‌تواند مشکلات جدی را برای سلامت انسان به همراه داشته باشد. برخی از این خطرات عبارتند از:

منبع اصلی دریافت اکراتوکسین A، مصرف مواد غذایی آلوده است و استنشاق یا تماس پوستی با این سم، در مقایسه با مصرف آن رایج نیست.
آژانس بین المللی تحقیقات روی سرطان (IARC)، اکراتوکسین A را به عنوان ترکیبی که احتمالاً باعث سرطان زایی در انسان می شود، در گروه  2Bطبقه بندی کرد. با اتصال اکراتوکسین A به DNA ، شروع سرطانی شدن یک سلول اتفاق می افتد.در صورت مصرف مواد غذایی آلوده به اکراتوکسین A، این سم به راحتی از طریق دستگاه گوارش بدن جذب شده و پس از اتصال به پروتئین اصلی خون (آلبومین)، در بخش های مختلف بدن ذخیره می شود. تحقیقات سازمان ایمنی مواد غذایی اروپا (EFSA)، نشان می دهد که در مقایسه با بافت های ماهیچه ای، چربی و شیر، اکراتوکسین A بیشتر در خون، کبد و کلیه تجمع می یابد. تحقیقات بیانگر آن است که در مقایسه با سایر اندام ها مانند کبد و همینطور سیستم ایمنی بدن، اکراتوکسین A بیشترین تاثیر را بر روی کلیه ها دارد.

اکراتوکسین A می تواند سبب ناباروری در آقایان و یا ایجاد سرطان بیضه در آنها شود. این سم با جلوگیری از ترشح هورمون تستوسترون (هورمون جنسی) و با تغییر شکل، کاهش تعداد و تحرک سلول اسپرم، روی سلامت مردان اثرات منفی زیادی می گذارد.

اکراتوکسین A می تواند از جفت عبور کرده و سبب اختلال در رشد اندام های بدن، ایجاد نقایص مادر زادی و یا حتی مرگ جنین شود. در صورت مصرف مواد غذایی آلوده به اکراتوکسین در زنان شیرده، این سم از طریق شیر به نوزاد منتقل می شود.از آنجایی که کودکان وزن کمتری دارند و تعداد دفعات بیشتری غذا مصرف می کنند، بیشتر در معرض خطر اکراتوکسین A قرار می گیرند. افراد مسن که سیستم ایمنی ضعیف تری دارند، همانند مادران و نوزادان، جزو گروه های پرخطر محسوب می شوند.

راهکارهای کاهش آلودگی اندازه‌گیری اکراتوکسین A در قهوه با روش HPLC

خرید از برندهای معتبر

راهکارهای مختلفی وجود دارند که می توانند تا حدودی خطرات ناشی از سموم قارچی در قهوه را کاهش دهند. برخی از این موارد عبارتند از:

اگر قهوه از برندهایی که شناخته‌ شده و معتبر هستند خریداری شود،  می‌توان این اطمینان را حاصل کرد که پردازش و ذخیره‌ سازی دانه‌های قهوه به درستی انجام شده‌ و احتمال آلودگی به سموم قارچی تا حدودی کاهش یافته است.

از جمله پارامتر هایی که می‌توانند شرایط مناسبی را برای رشد قارچ‌ها و تولید سموم قارچی فراهم کنند، رطوبت و دمای بالا هستند. بنابراین، نگهداری و ذخیره سازی دانه‌ های قهوه در شرایط خشک و خنک میتواند تا حدودی از رشد قارچ‌ها جلوگیری کند.

از آنجایی که قهوه یک ترکیب جاذب رطوبت است و در هنگام انبارداری و حمل و نقل می تواند آب را جذب کند، بنابراین سطح رطوبت دانه قهوه (قهوه سبز و یا فرآوری شده) نباید بیشتر از 12.5 درصد باشد.

در هنگام ذخیره سازی قهوه، در صورت رعایت شرایط محیطی همچون دمای زیر 20 درجه سانتی گراد و رطوبت نسبی 50 تا 70 درصد، آلودگی اکراتوکسین A کاهش می یابد.

ذخیره‌سازی صحیح

فرآیند خشک کردن دانه‌ های قهوه باید به درستی انجام شود و دانه‌ها به طور یکنواخت خشک شوند تا رطوبت اضافی که می‌تواند باعث رشد قارچ‌ها شود، حذف گردد.

بسیاری از شرکت‌های تولید کننده قهوه از روش‌های غربال‌ گری و آزمایش برای تشخیص سموم قارچی در دانه‌های قهوه استفاده می‌کنند. این اقدامات تا حدودی می‌تواند به کاهش میزان سموم قارچی در محصول نهایی کمک کند.

یکی از عواملی که می‌تواند تأثیر مثبتی بر روی کاهش آلودگی سموم قارچی و بالا بردن کیفیت محصول نهایی داشته باشد ، آموزش و افزایش آگاهی کشاورزان می باشد. زیرا روش‌های صحیح برداشت، خشک کردن و ذخیره ‌سازی دانه‌های قهوه در این فرآیند بسیار مهم و تاثیرگذارند.

تحقیقات نشان می دهند که مصرف ویتامین های مختلف از جمله E، C و A می تواند باعث تاثیر بسزایی در کاهش سمیت اکراتوکسین A در بدن انسان شود.

عسل هم به دلیل داشتن ترکیبات آنتی اکسیدانی مانند کوئرستین ممکن است تا حدی با سمیت اکراتوکسین A مقابله کند.
علاوه بر اکراتوکسین A، اثرات سمی سایر مایکوتوکسین ها از قبیل آفلاتوکسین B1، داکسی نیوالنول و زیرالنون نیز در اثر برهمکنش با ویتامین A می تواند کاهش پیدا کند.

خشک‌کردن یکنواخت دانه‌ها

فرآیند خشک‌کردن باید به‌گونه‌ای انجام شود که تمامی دانه‌ها به‌طور یکنواخت خشک شوند تا از رشد قارچ‌ها جلوگیری شود.

مصرف آنتی‌اکسیدان‌ها

ویتامین‌های A، C و E می‌توانند سمیت اکراتوکسین A را در بدن کاهش دهند. همچنین، مصرف عسل به دلیل ترکیبات آنتی‌اکسیدانی‌اش تأثیر مثبتی دارد.

نتیجه‌گیری

اکراتوکسین سمی از خانواده مایکوتوکسین هاست که به وسیله بعضی گونه های قارچ های آسپرژیلوس و پنی سیلیوم تولید می شود. این سموم قارچی می‌توانند در مراحل مختلف زنجیره تولید قهوه، از زمان برداشت تا خشک کردن، ذخیره‌ سازی و حتی حمل ‌ونقل به دانه‌های قهوه نفوذ کنند. از جمله شرایطی که می تواند تولید سموم قارچی را تسهیل کند، بالا بودن دما و رطوبت و همچنین ذخیره سازی نامناسب محصول است. مصرف قهوه آلوده به سموم قارچی می‌تواند باعث جهش زایی، سرطان زایی، سرکوب سیستم ایمنی بدن و اثرات سو روی کبد و کلیه ها شود.

بنابراین اندازه گیری و تلاش برای کاهش آلودگی اکراتوکسین A در تمامی مراحل کشت، فرآوری و ذخیره سازی قهوه بسیار مهم است. بیشینه رواداری مجازی که استاندارد ملی ایران تعیین کرده است، برای انواع دانه و پودرقهوه برشته شده به جز قهوه فوری ppb 5 و انواع قهوه فوری، پودر مخلوط قهوه فوری و فرآورده های آن ppb  10 می باشد.

پرسش‌ها و پاسخ‌های اندازه‌گیری اکراتوکسین A در قهوه با روش HPLC

اکراتوکسین A چیست و چگونه تولید می‌شود؟

اکراتوکسین A یکی از مایکوتوکسین‌های خطرناک است که توسط قارچ‌های آسپرژیلوس و پنی‌سیلیوم تولید می‌شود. این سم معمولاً در شرایط دمای بالا و رطوبت مناسب در محصولات کشاورزی مانند قهوه، غلات و میوه‌های خشک به وجود می‌آید.

چرا اکراتوکسین A در قهوه خطرناک است؟

قهوه آلوده به اکراتوکسین A می‌تواند باعث جهش ژنتیکی، سرطان، آسیب به کبد و کلیه‌ها و کاهش عملکرد سیستم ایمنی شود. مقاومت بالای این سم در برابر حرارت، خطرات آن را در مراحل فرآوری کاهش نمی‌دهد.

اندازه‌گیری اکراتوکسین A در قهوه با روش HPLC؟

برای شناسایی اکراتوکسین A در قهوه، از روش کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC) استفاده می‌شود. این روش شامل استخراج، تصفیه و اندازه‌گیری دقیق مقدار سم در نمونه‌های غذایی است.

حداکثر مجاز اکراتوکسین A در قهوه چقدر است؟

بر اساس استاندارد ملی ایران، میزان مجاز اکراتوکسین A در دانه و پودر قهوه برشته شده 5 µg/kg و در قهوه فوری و فرآورده‌های آن 10 µg/kg است.

آیا فرآوری و حرارت می‌تواند اکراتوکسین A را از بین ببرد؟

خیر، اکراتوکسین A مقاومت بالایی در برابر حرارت دارد و حتی در دماهای 80 تا 120 درجه سانتی‌گراد نیز از بین نمی‌رود. بنابراین، استفاده از روش‌های دیگر مانند غربال‌گری دقیق و ذخیره‌سازی صحیح ضروری است.

چه عواملی باعث تولید اکراتوکسین A در قهوه می‌شوند؟

رطوبت بالای دانه‌های قهوه (بیش از 13 درصد)، دمای نامناسب در انبارداری، و شرایط غیربهداشتی در فرآیند برداشت و ذخیره‌سازی، از مهم‌ترین عوامل تولید اکراتوکسین A هستند.

چگونه می‌توان خطرات اکراتوکسین A را کاهش داد؟

برای کاهش خطرات این سم:

از برندهای معتبر قهوه خرید کنید.

دانه‌های قهوه را در شرایط خشک و خنک نگهداری کنید.

اطمینان حاصل کنید که دانه‌ها یکنواخت خشک شده‌اند.

مصرف آنتی‌اکسیدان‌هایی مانند ویتامین C، E و A می‌تواند به کاهش اثرات سم کمک کند.

آیا مصرف قهوه آلوده به اکراتوکسین A می‌تواند سرطان‌زا باشد؟

بله، آژانس بین‌المللی تحقیقات سرطان (IARC) اکراتوکسین A را به‌عنوان ماده‌ای که احتمالاً سرطان‌زا است، طبقه‌بندی کرده است. این سم با آسیب به DNA و تحریک جهش‌های ژنتیکی خطر ابتلا به سرطان را افزایش می‌دهد.

آیا مصرف عسل می‌تواند اثرات اکراتوکسین A را کاهش دهد؟

تحقیقات نشان داده است که ترکیبات آنتی‌اکسیدانی موجود در عسل، مانند کوئرستین، می‌تواند اثرات سمی اکراتوکسین A را کاهش دهد. بااین‌حال، این روش یک درمان قطعی نیست و پیشگیری از آلودگی اولیه ضروری است.

کدام قارچ‌ها بیشترین سهم را در تولید اکراتوکسین A دارند؟

قارچ‌های آسپرژیلوس اکراسئوس، آسپرژیلوس کربوناریوس و پنی‌سیلیوم وروکوزوم از مهم‌ترین تولیدکنندگان اکراتوکسین A هستند.